混合菌协同降解煤泥水中聚丙烯酰胺的试验研究
0 引 言
随着煤炭开采的不断深入，煤炭分选加工难度增加，环境问题日渐凸显，选煤工艺需进一步改善[1-3]。聚丙烯酰胺具有良好絮凝性、水溶性，主要应用于湿法选煤中煤泥水絮凝[4]。聚丙烯酰胺在自然条件下会自发缓慢降解，产生的丙烯酰胺单体有毒性，损害动物大脑[5]。此外，残留的聚丙烯酰胺会减弱煤泥对浮选药剂的吸附，降低浮选效果[6]，且聚丙烯酰胺会使煤泥水黏稠，流动性变差，增加煤泥水处理难度。因此，有必要处理选煤厂煤泥水中聚丙烯酰胺。含聚污水的处理方法主要包括物理法[7]、化学法[8]、化学与生物联合法[9-10]和生物法[11]等。其中生物法具有环境友好、高效、安全、无二次污染等优点。对聚丙烯酰胺有降解作用的微生物广泛存在于污泥、土壤、污水中，且大多数是细菌。Yu等[12]从含聚丙烯酰胺干污泥中分离出一种恶臭假单胞菌，聚丙烯酰胺的降解率超过45%。但恶臭假单胞菌是一种少见的条件致病菌，对人类健康和环境生物有害。Wen等[13]从受聚丙烯酰胺污染的土壤和活性淤泥中分别分离出氟氏芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，考察了对聚丙烯酰胺的降解效果，发现两菌株皆以聚丙烯酰胺为唯一碳源。Li等[14]在大庆油田注水管道里检测出假单胞菌属、脱硫球茎菌科、草酸杆菌科、黄杆菌科、产碱杆菌科等，皆可将聚丙烯酰胺降解成低分子量聚合物和寡聚物。
近年来，研究者们开始利用菌种间协同作用降解聚丙烯酰胺。Kunichika等[15]从土壤里分离出2种纯菌株复合体系，发现该复合体系可以打断聚丙烯酰胺分子的碳主链，提供微生物生长所需的碳源。Bao等[16]从聚合物趋油水样中分离出2种芽孢杆菌株，考察其协同降解效果，并对降解过程进行初探。研究表明，混合菌先将聚丙烯酰胺的侧链酰胺基水解成羧基，再将聚丙烯酰胺碳骨架氧化分解。Liu等[17]利用液质联动仪研究降解产物，发现好氧颗粒污泥水解聚丙烯酰胺的酰胺基侧链，主要中间产物是低分子量的聚丙烯酸，无丙烯酰胺单体产生。Sang等[18]发现含有红球菌和蜡样芽孢杆菌的活性淤泥将聚丙烯酰胺碳骨架降解成高分子碎片，且碳骨架比侧链酰胺基更难降解。徐敬尧等[19]发现球红假单胞菌对褐煤有降解作用。张东晨等[20-21]发现球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌皆对煤炭有良好的絮凝效果，同时，有降解作用。黄孢原毛平革菌可有效降解交联丙烯酸聚合物[22]。在限氮条件下，黄孢原毛平革菌分泌胞外酶对聚丙烯酰胺进行降解，降解效果好于氮源充足时[23]。
目前，聚丙烯酰胺生物降解研究的菌种选择主要集中在细菌类，对真菌类降解菌的研究报道较少，且降解研究对象主要是石油领域的含聚废水。本文将真菌类黄孢原毛平革菌与细菌类球红假单胞菌按相同体积比混合，研究混合菌对煤泥水中聚丙烯酰胺的协同降解效果，确定了降解因素的最佳组合，并采用黏度法、红外光谱、酶活测定等检测手段，对降解产物和降解液进行分析，为探究和揭示混合菌的降解规律提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 菌种、培养基和条件驯化
1.1.1 菌种来源
球红假单胞菌属于红螺菌科红假单胞菌属，兼性厌氧、革兰氏阴性细菌，适合在中性室温环境下生长。试验所用的球红假单胞菌来自中国矿业大学化工学院生物实验室，密封保存于冰箱中。黄孢原毛平革菌属担子菌纲，好氧型嗜热真菌，适合在pH=4～5下生长。试验用黄孢原毛平革菌编号为GIM 3.393，购于广东省微生物菌种保藏中心，密封保存于冰箱中。将上述菌种活化后，分别进行平板划线，生长情况如图1所示，具体性质见文献[20-21]。
图1 菌种生长情况
Fig.1 Condition of strain growth
1.1.2 培养基
基础培养基(L-1)：马铃薯淀粉 20 g、葡萄糖 20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、维生素B1 8 mg、pH=6。 降解培养基(L-1)：酒石酸铵 0.2 g、聚丙烯酰胺 500 mg、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO4 3 g、维生素B1 8 mg、微量元素溶液 10 mL、pH=6。微量元素溶液(L-1)：CuSO4·5H2O 0.8 g、MnCl2·4H2O 1 g、ZnSO4·7H2O 1.2 g。
以上培养基均在120 ℃灭菌30 min。
1.1.3 条件驯化
将20 mL人工配制含聚丙烯酰胺无菌的煤泥水试样和80 mL基础培养基混合；采用接种环挑取单菌落进行真菌或细菌接种；置于温度30 ℃、转速120 r/min摇床振荡培养。每隔24 h倒出20 mL上清液，加入20 mL人工配制含聚丙烯酰胺无菌的煤泥水试样。5 d后，将2 mL真菌孢子悬液与细菌菌液分别接种于锥形瓶(含50 mL基础培养基和150 mL人工配制含聚丙烯酰胺无菌的煤泥水试样)。3 d后，每隔24 h倒出50 mL上清液，再加入50 mL人工配制含聚丙烯酰胺无菌的煤泥水试样，持续7 d。
1.2 试验材料
聚丙烯酰胺购自河南省巩义市水处理材料公司，属于阴离子型，分子量1 200万，分子结构如图2所示。煤泥水试样取自淮南矿业集团望峰岗选煤厂的浓缩池溢流液，pH=7.2，煤泥水浓度为39.1 g/L，煤泥水中煤泥粒度组成及灰分见表1。由表1可知，粒径小于45 μm颗粒占比近50%，灰分偏高，说明该煤泥水中含有大量细粒高灰煤泥。
图2 阴离子型PAM分子结构
Fig.2 Molecular structure of anion PAM
表1 煤泥粒度组成和灰分
Table 1 Particle size composition and ash of coal slime
煤泥水中煤泥的XRD分析图谱如图3所示，可知该煤泥水中矿物组成为高岭石、石英、方解石、硬石膏、黄铁矿和赤铁矿等，其中高岭石和石英亲水性极强，是煤泥水难沉降的主要因素。为模拟实际选煤厂的聚丙烯酰胺，人工配置成浓度500 mg/L的含聚丙烯酰胺煤泥水试样，灭菌后备用。
图3 煤泥XRD分析图谱
Fig.3 XRDanalysis of coal slime
1.3 降解试验
先将0～10 g/L葡萄糖和100 mL降解培养基添加至250 mL锥形瓶，将等体积混合的球红假单胞菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液接种于锥形瓶，然后调pH至设定值，在一定温度和转速下摇床振荡培养6 d，最后经6 000g高速离心10 min。取上清液采用淀粉-碘化镉法[24]，在585 nm处测吸光度A。每次试验平行进行3次，取平均值。试验仪器为UV-5100紫外可见分光光度计。根据标准曲线计算降解后聚丙烯酰胺的浓度。标准曲线回归方程为
y=0.013 29x-0.705 78，
(1)
式中，y为吸光度A；x为聚丙烯酰胺质量浓度，mg/L。
聚丙烯酰胺的降解率η为
(2)
式中，C0、Ct分别为降解前、后聚丙烯酰胺的质量浓度，mg/L。
1.4 降解产物
将降解前后的降解液经6 000g离心10 min，添加甲醇以去除无机盐，取上清液于50 ℃真空干燥备用。经溴化钾压片，采用美国伯乐公司的BIO-RAD FTS3000型红外光谱仪进行红外光谱分析[13,16]。用黏度法[25]分别测定降解前后聚丙烯酰胺的黏均分子量，其中马克-豪温经验公式为
[η]=KMα，
(3)
式中，K、α为经验常数，K=4.75×10-3，α=0.80；[η]为特性黏度，mL/g；M为黏均分子量。
1.5 酶的提取与活性测定
将降解后的降解液经10 000 r/min离心10 min，取上清液30 mL分装于3个锥形瓶；分别添加酒石酸缓冲液(pH=3)、丁二酸缓冲液(pH=4.5)和柠檬酸盐缓冲液(pH=5)，振荡提取1 h；经4 200 r/min离心10 min，取上清液经0.45 μmol滤膜过滤，得滤液备用[26-27]。
1)木质素过氧化物酶(Li P)：将滤液0.4 mL、0.1 mol/L酒石酸缓冲液1.5 mL、10 mmol/L黎芦醇1.0 mL及10 mmol/L过氧化氢0.1 mL依次添加至小烧杯，在310 nm处测反应1 min前后吸光度的变化。一个酶活力(U)定义为每分钟使1 μmol黎芦醇氧化成黎芦醛所需的酶量。
2)锰过氧化物酶(Mn P)：将滤液0.4 mL、0.05 mol/L丁二酸缓冲液2.0 mL、15 mmol/L MnSO4 0.5 mL及10 mmol/L过氧化氢0.1 mL依次添加至小烧杯，在240 nm处测定反应1 min前后吸光度的变化。一个酶活力(U)定义为每分钟使1 μmol Mn2 氧化成Mn3 所需的酶量。
3)漆酶(Lac)：将滤液0.5 mL、0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液2.0 mL及1.0 mmol/L ABTS 0.5 mL依次添加至小烧杯，在420 nm处测定反应1 min前后吸光度的变化。一个酶活力(U)定义为每分钟使1 μmol ABTS氧化成ABTS 所需的酶量。
2 结果与讨论
2.1 单菌种与混合菌降解能力比较
为了比较单菌种与混合菌降解效果，在接菌量2 mL、葡萄糖浓度2 g/L、30 ℃、pH= 6和摇床转速130 r/min反应条件下，设计了单菌种和混合菌对比试验，结果如图4所示。可知球红假单胞菌、黄孢原毛平革菌和混合菌的降解率分别为24.9%、30.2%和34.3%，混合菌降解率最高。这是因为菌种之间的协同效应，能更有效降解底物聚丙烯酰胺[15]。因此，选择混合菌作为后续试验菌种。
图4 单菌种与混合菌降解能力比较
Fig.4 Comparison of degradation ability between single strain and mixed strain
2.2 葡萄糖浓度的影响
在接菌量2 mL、35 ℃、pH=6和摇床转速130 rmin反应条件下，葡萄糖浓度对聚丙烯酰胺降解效果如图5所示。葡萄糖是传统的碳源，在该降解体系中作为共基质，低浓度的葡萄糖促进微生物降解。葡萄糖浓度过高时，微生物倾向于利用葡萄糖作为碳源，进而不利于聚丙烯酰胺的降解。可知，不添加葡萄糖时，降解率仅为14.9%，此时培养基中没有任何外加碳源，体系以聚丙烯酰胺为唯一碳源。葡萄糖浓度低于2 g/L时，随着葡萄糖浓度的升高，降解率从14.9%升至35.9%，这是由于混合菌利用低浓度的葡萄糖作为共基质底物，共代谢促进降解[28]；另一方面，低浓度葡萄糖刺激混合菌分泌更高水平的降解酶[13]。葡萄糖浓度由2 g/L升至10 g/L，降解率下降至24.3%，这是由于混合菌利用过量的葡萄糖作为主要碳源，而不以聚丙烯酰胺为碳源去满足微生物的生长和代谢[29]。因此，选2 g/L作为后续培养基中葡萄糖的浓度。
图5 葡萄糖浓度对聚丙烯酰胺降解的影响
Fig.5 Effect of glucose concentration on polyacrylamide degradation
2.3 环境条件对聚丙烯酰胺降解效果的影响
2.3.1 温度的影响
在接菌量2 mL、pH=6和摇床转速130 r/min反应条件下，考察混合菌液降解体系在不同温度下对聚丙烯酰胺的降解效果，如图6所示。可知低于35 ℃时，随温度升高，降解率从23.2%升至35.9%，这是由于升高温度会使反应速率常数变大，促进降解反应的进行；另一方面，在一定范围内升高温度会增强微生物新陈代谢，加快降解酶的分泌。温度由35 ℃升至50 ℃时，降解率下降至9.8%，这是由于降解酶的本质是具有催化活性的蛋白质，温度过高使酶变性失活[29]。因此，适宜温度为35 ℃。
图6 温度对聚丙烯酰胺降解的影响
Fig.6 Effect of temperature on polyacrylamide degradation
2.3.2 初始pH的影响
在接菌量2 mL、35 ℃和摇床转速130 r/min反应条件下，不同初始pH对降解体系聚丙烯酰胺降解效果的影响如图7所示。可知初始pH由4增至6时，降解率从20.1%升至35.9%，这是由于pH过高或过低都会影响混合菌的生长，同时影响降解酶的活性。适宜的pH能保证混合菌生长快速和分泌酶的活性高，所以适宜的pH有利于降解[30]。初始pH增加至9时，降解率反而下降，这是由于在极端pH条件下，降解酶变性失活，代谢停止，生长量快速减少[31]。因此，最适初始pH为6。
图7 初始pH对聚丙烯酰胺降解的影响
Fig.7 Effect of initial pH on polyacrylamide degradation
2.3.3 接种剂量的影响
在35 ℃、pH=6和摇床转速130 r/min下，不同接种剂量对聚丙烯酰胺降解效果如图8所示。可知接种剂量从1 mL增至2 mL后，降解率从19.6%升至35.9%，这是因为增加接种剂量会缩短微生物生长的迟滞阶段，从而快速进入指数增长阶段，有利于底物的降解[30]。接种剂量增至5 mL时，降解率反而下降，这是由于过量的接菌量不利于微生物对营养物质的利用，增强了菌种间的竞争，导致降解效果下降。文献[32]考察铜绿假单胞菌的接种量对聚丙烯酰胺降解的影响，呈现相似的降解趋势。因此，最佳接种剂量为2 mL。
图8 接种剂量对聚丙烯酰胺降解的影响
Fig.8 Effect of inoculum dosage on polyacrylamide degradation
2.3.4 摇床转速的影响
试验所用菌种是好氧菌，通过控制摇床转速可以调节降解培养基中含氧量，摇床转速越大，表明微生物生长的环境含氧量越大。在反应条件接菌量2 mL、35 ℃和pH=6下，摇床转速对聚丙烯酰胺降解效果的影响如图9所示。
由图9可知，摇床转速从70 r/min增至140 r/min时，降解率从22.8%上升至37.5%，这是由于降解培养基中含氧量的增加促进微生物的代谢，进而加快对聚丙烯酰胺的降解。摇床转速从140 r/min增至160 r/min时，降解率几乎不变，可知降解培养基中的含氧量达到饱和，不再增加。因此，最佳摇床转速为140 r/min。
图9 摇床转速对聚丙烯酰胺降解的影响
Fig.9 Effect of shaker speed on polyacrylamide degradation
2.4 多因素对聚丙烯酰胺降解效果的影响
2.4.1 正交试验
为考察多因素对聚丙烯酰胺降解效果的影响，采用正交试验设计[33]。试验因素水平见表2，试验结果分析见表3。
表2 正交试验因素和水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal design
表3 正交试验结果分析
Table 3 Analysis of orthogonal test L9(34)
通过极差分析，因素影响顺序为温度>初始pH>接种剂量>摇床转速。摇床转速对降解效果影响最小，后续方差分析中作为误差处理。最优因素组合为A2B2C1D2，即温度35 ℃、初始pH=6、接种剂量2 mL和摇床转速140 r/min。试验结果与单因素试验最佳组合结果一致。
2.4.2 方差分析
根据正交试验可视化分析得到的数据，进一步分析变量。临界F值表明数据的显著性。计算各变量的F值，然后与临界F值比较，具体见表4。可知在试验因素水平范围内，温度对降解效果影响显著，是主要的影响因素。
表4 方差分析
Table 4 Analysis of variance
2.4.3 试验结果预测
采用Minitab软件的预测田口结果功能，选取最优水平组合A2B2C1D2进行预测，优化结果预测见表5，可知最优试验组合的预测均值为37.1%，这与实际值37.5%相差不大，说明正交试验正确。
表5 优化结果的预测
Table 5 The forecast of optimal result
2.5 混合菌以聚丙烯酰胺为氮源的生长结果
在接菌量2 mL、葡萄糖浓度2 g/L、35 ℃、pH=6和摇床转速140 r/min的最优试验条件下，将混合菌接种于不添加酒石酸铵的降解培养基，与上述降解情况进行对比，结果如图10所示。
图10 聚丙烯酰胺作为唯一氮源的降解
Fig.10 Degradation of polyacrylamide as sole nitrogen source
由图10可知在无外加氮源的条件下，随着降解反应的进行，在6 d内从3.2% 升至33.1%，说明混合菌以聚丙酰胺作为唯一氮源进行降解。在相同条件下，添加酒石酸铵时降解率为37.5%，这可能因为添加少量酒石酸铵时，诱导混合菌分泌更多的生物酶，更高效催化降解聚丙烯酰胺[22-23]。继续延长时间至10 d时，降解率几乎不变，表明聚丙烯酰胺只能部分降解[13]。
2.6 降解产物红外光谱
利用红外光谱对降解前后的聚丙烯酰胺进行分析，结果如图11所示。可知降解前后的聚丙烯酰胺结构发生很大改变。降解后在3 100～3 500 cm-1内出现宽大的吸收峰，这是受O—H伸缩振动的影响；1 660 cm-1左右出现的吸收峰是C
O伸缩振动的结果；1 415 cm-1左右的C—N伸缩振动峰和1 640 cm-1左右的 N—H 弯曲振动峰完全消失，说明降解后结构没有酰胺侧链。说明聚丙烯酰胺在微生物作用下，酰胺侧链水解为羧基，进一步说明混合菌以聚丙烯酰胺作为氮源[13,18]。
图11 聚丙烯酰胺降解前后的红外光谱
Fig.11 IR spectrum of polyacrylamide before and after degradation
2.7 降解前后黏均分子量变化
聚丙烯酰胺是长链高分子聚合物，黏性与分子量、结构、水解等有关。其他条件不变时，采用黏性表征分子量。一般侧链对聚合物分子量的影响很小，只有分子的主链断裂才能引起分子量变化。对降解前后的聚丙烯酰胺进行黏均分子量测定，结果见表6。可知降解后聚丙烯酰胺的分子量发生很大变化，这可能是由于混合菌分泌强氧化酶，将碳链主链氧化断裂，混合菌利用聚丙烯酰胺作为碳源[34]。
表6 聚丙烯酰胺降解前后黏均分子量的变化
Table 6 Variation of viscosity-average molecular weights of polyacrylamide before and after degradation
2.8 降解后酶活测定
对降解后的培养基进行酶活测定，结果如图12所示。可知降解后的培养基存在木质素过氧化物酶(Li P)、锰过氧化物酶(Mn P)及漆酶(Lac)3种强氧化酶，酶活分别为6.73、12.09和16.48 U/mL，说明在Li P、Mn P和Lac等强氧化酶作用下，混合菌将聚丙烯酰胺分解成低聚物，导致分子量降低。
图12 不同酶的活性
Fig.12 Activity of different enzymes
3 结 论
1)由于混合菌具有协同增效降解作用，其降解效果优于单一菌种。球红假单胞菌、黄孢原毛平革菌及混合菌的降解率分别为24.9%、30.2%和34.3%。葡萄糖作为共基质，低于2 g/L时，对聚丙烯酰胺的降解具有促进作用；高于2 g/L时，对聚丙烯酰胺的降解具有抑制作用。
2)单因素试验与正交试验相互验证，得到的最佳组合为接种剂量2 mL、温度35 ℃、pH=6、摇床转速140 r/min。，此时聚丙烯酰胺的降解率达到37.5%。在试验设计的因素水平范围内，因素影响顺序为温度>初始pH>接种剂量>摇床转速，温度是主要的影响因素。
3)在最优条件、不添加酒石酸铵时，降解率达33.1%，低于添加酒石酸铵的37.5%，说明添加少量酒石酸铵可促进微生物降解。红外光谱证明混合菌以聚丙烯酰胺为氮源。黏均分子量及酶活测定表明，在混合菌分泌的胞外酶木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶等强氧化酶作用下，聚丙烯酰胺的碳主链氧化断裂，为微生物生长提供碳源。
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Experimental study on co-degradation of polyacrylamide in coal slime water by mixed bacteria
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ZHANG Dongchen,WANG Fanglue,WANG Tao，et al.Experimental study on co-degradation of polyacrylamide in coal slime water by mixed bacteria[J].Clean Coal Technology，2021,27(1):209-216.
