沁水煤田赵庄矿区煤微生物产甲烷能力分析
摘 要：为提高沁水煤田赵庄矿区的煤层气井产量，以煤地质微生物产甲烷理论为基础，采取本矿区煤层气井水，在荧光显微镜及古菌16s rDNA V6高变区宏基因组测序验证菌源可靠性后，采用厌氧培养的方法，分别在小型玻璃瓶和中型发酵罐中开展了为期49 d的煤炭生物转化模拟试验，分析了成气过程中菌群数量变化、成气规律，进行了产气试验后煤的工业分析、煤表面扫描电子显微镜观察。结果显示，小型和中型模拟试验中所产甲烷气体含量分别高达25%、31%;2个模拟试验菌液中菌群数量的变化均为缓慢增长、显著增加、趋于减缓3个阶段，与成气规律基本一致;对试验前后煤样工业分析进行比对后，发现固定碳含量和挥发分都有所下降;且观察到附着在煤表面进行煤降解的产甲烷菌群落。山西沁水煤田赵庄矿区的本源产甲烷微生物菌群可以对煤进行有效降解，并产生甲烷。
关键词：厌氧培养;生物转化;宏基因组;扫描电子显微镜;产甲烷菌群落
0 引 言
自从Scott等在1994年明确提出煤层气的次生生物成因[1]和Strapo
提出煤中的杂环大分子化合物可以作为碳源被微生物降解以来[2-3]，许多学者致力于将微生物在一定条件下作用于煤，产生甲烷的研究。Gupta 等[4]认为矿井水中的微生物群落更适合用于煤的生物降解，并分析了矿井水中微生物群落。Fallgren 等[5]通过采集澳大利亚、印尼和中国的褐煤煤样进行了本源微生物降解煤产甲烷试验，结果证实，通过添加营养物质激活褐煤中的本源微生物产生甲烷是可行的。Green 等[6]从粉河盆地煤层气田产出水中富集了降解煤产甲烷的微生物菌群，并通过试验模拟，将富集菌群作用于一定条件下的煤，成功产出了甲烷。在利用微生物降解煤产甲烷机理清晰的条件下[7-9]，国外的学者更多的关注于本源微生物对煤的生物降解。而国内研究学者更多的关注外源微生物对煤的生物降解研究，并取得了可喜成果。林海课题组从厌氧污泥中富集了产甲烷菌群并以煤为碳源对其进行了驯化，证实该菌群可以利用乙酸盐和甲醇产甲烷，也可以利用煤产生甲烷[10-11]。王爱宽等[12-14]从褐煤中富集得到了厌氧微生物菌群，通过生物气生成模拟试验验证，证实该菌群能够降解褐煤产甲烷。苏现波等[15]、夏大平等[16]也对微生物降解煤产甲烷过程中的盐度、pH 和氧化还原电位对降解效果的影响做了详细研究。本文针对企业在沁水煤田赵庄矿区的煤层气井产量较少、产量走低的问题，采集赵庄矿区的煤样和煤层气井出水，利用小瓶厌氧培养和发酵罐厌氧培养的方法，探究本源微生物作用于该矿区煤的产甲烷能力，为日后的原位生物转化打下基础。
1 试 验
1.1 材料
1.1.1 煤样
试验用煤样采自沁水煤田赵庄矿区主采煤层，5～15 cm块状，堆放半年以上。将部分煤样敲碎至2～3 cm，球磨机研磨2 min，过筛，取250～420 μm置于厌氧操作箱中;另一部分煤样敲碎至5～6 cm，放置于自制煤样罐，并通入氮气保持无氧环境。
1.1.2 菌群
试验用菌群取自赵庄矿区煤层气井出水口，一部分封口置于厌氧操作箱中，另一部分放入灭菌的密封罐体中，通入氮气保持无氧环境。对原始水样利用显微镜直接计数法进行计数，结果为2.0×108，在荧光显微镜下用420 nm波长入射光照射，进行荧光观察，确保水样中含有产甲烷菌。
1.1.3 主要试剂和仪器
HIRAYAMA HVE-50灭菌锅，球磨机，DWS厌氧操作箱，安捷伦7890A气相色谱，OLYMPUS BX41荧光显微镜，自制可控温100 L发酵罐，自制煤样罐，乙酸钠、葡萄糖等主要试剂购自国药，LRH-500F恒温培养箱，三德SDLA618工业分析仪，德国卡尔蔡司EVO MA15扫描电子显微镜，T100 Thermal CyclerPCR仪，Doc EZ System 凝胶成像系统。
1.2 水样中古菌DNA提取、PCR及高变区测序
将新鲜的水样经滤纸过滤去除杂质，再经0.22 μm微孔滤膜过滤。DNA的提取使用OMEGA Water DNA Kit水样试剂盒，操作步骤按照试剂盒说明进行;古菌16S rDNA PCR(聚合酶链式反应)扩增引物采用21F、958R[17-18]，序列为TTCCGGTTGATCCYGCCGGA、YCCGGCGTTGAMTCCAATT。PCR扩增体系：Premix Tag 25 μL、Template 5 μL、上下游引物ddH2O各2.5 μL。古菌16S rDNA扩增程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 20 s，35个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行检测;胶回收纯化使用中科瑞泰琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行，步骤参照试剂盒说明。对纯化后的PCR产物外送至深圳华大基因科技服务有限公司进行测序，将获得的序列提交至GeneBank数据库，确定菌株分类。
1.3 培养基的制备
小瓶试验培养基成分如下：K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.2 g，NH4Cl 0.2 g，MgCl2 0.1 g，乙酸钠 1.7 g，YE(酵母抽提物)1.0 g，碳酸氢钠0.025 g，葡萄糖2 g。称量化合物并依次溶解，添加纯水至240 mL，用锡箔纸封口，灭菌后放入厌氧操作箱中，加入0.5 g的半胱氨酸，调节pH至7.0，加入氧化还原指示剂刃天青(0.1%)1 mL，待培养基变为无色后备用。
中型发酵罐培养基成分中不再加入半胱氨酸、氧化还原指示剂，其他成分与小瓶试验培养基成分相同，按照比例放大100倍，置于灭菌的罐体中，通入氮气保持无氧环境。
1.4 煤生物转化试验
1.4.1 小型煤生物转化试验
选用100 mL小型厌氧瓶作为培养瓶，设置3组试验，A组40 mL培养基加5 g煤粉加20 mL菌液，编号为1-1、1-2、1-3;B组40 mL培养基加20 mL菌液，编号为2-1、2-2、2-3;C组煤粉5 g加纯水20 mL作为对照组，编号为CK;共计7小组。将充分研磨后250～420 μm煤样和灭菌后的培养基在厌氧操作箱中称量分装。取出后放入35 ℃恒温培养箱中培养。7、14、21、28 d检测产生气体组分中甲烷含量和菌群数量。
1.4.2 中型发酵罐煤生物转化试验
将10 kg粒径5～6 cm的煤样从密封罐中取出，倒入经紫外灭菌的100 L自制可控温厌氧发酵罐中，加入制备好的60 L培养基，从发酵罐底部通入氮气10 min，以保持培养基和罐中的厌氧环境。设置2个平行试验编号G-1、G-2。7、14、21、28 d检测产生气体组分中甲烷含量和菌群数量。并在试验结束后选取5 mm×5 mm×5 mm左右的煤样做煤表面扫描电镜观察。
1.5 甲烷气体含量测定
甲烷气体含量的测定采用安捷伦7890A气相色谱仪进行测定。色谱柱为Agilent Carbonplot (60 m×320 μm)，载气为高纯N2。填充柱进样口温度150 ℃，隔垫吹扫流量3 mL/min，进样量500 μL，柱箱温度25 ℃，保持7.5 min，检测器为TCD，检测温度200 ℃，参比流量400 mL/min，尾吹流量8 mL/min。
甲烷含量=甲烷实际出峰面积×(标气中甲烷浓度/标气中甲烷平均峰面积)。
1.6 菌群数量测定
试验中菌群数量的测定采用显微镜计数法进行计数。将计数板和盖玻片擦干备用。在7小组试验中分别抽取10 μL发酵液，每个添加990 μL纯水，将发酵液稀释100倍，混匀，滴入计数板内，操作就绪后，在显微镜下选取四角加中间五格进行计数，菌数量计算公式N=五格总菌数×5×100×104。
1.7 煤样理化性质测定
采用GB/T 212—2008《煤的工业分析方法》对小型试验250～420 μm煤样进行工业分析，采用扫描电子显微镜对中型发酵罐试验后的煤表面进行观察并拍照。
2 结果与讨论
2.1 水样中产甲烷菌荧光显微镜观察分析
将去杂质后的水样在荧光显微镜下，经420 nm波长入射光照射，甲烷菌发出荧光，照片如图1所示，证实了水样中甲烷菌的存在。
图1 产甲烷菌荧光照片
Fig.1 Fluorescent image of methanogens
图2 PCR扩增产物凝胶电泳
Fig.2 Gel electrophoresis figure of amplification products
2.2 古菌V6高变区测序结果分析
经PCR扩增古菌V6区后，对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，1-16各样本与Marker(MI-HindⅢ、M2-DL2000)电泳结果如图2所示，可以看出各样本扩增产物电泳条带清晰，电泳效果良好，大小在100 bp(100个碱基对)左右，古菌16s rDNA目的片段扩增成功。
将华大基因所得序列在GeneBank数据库中比对后，得出以下结果：水样中的古菌类群都属于广古菌门，包含了甲烷微菌纲和甲烷杆菌纲，含有甲烷微菌目、八叠球菌目、甲烷杆菌目，细分为甲烷鬃菌科、甲烷杆菌科，最后划分为甲烷砾菌属、甲烷丝状菌属、甲烷细菌属。此结果从更精准的基因层面再一次确定了水样中甲烷菌的存在，保证了试验水样的可靠性。
2.3 煤生物转化产气规律
2.3.1 小型煤生物转化试验产气规律
小型煤生物转化试验产出气体组分中甲烷含量、产气趋势如图3所示。
图3 小型煤生物转化试验产气趋势
Fig.3 Gas trends of small coal bioconversion experiment
由图3可知，A组试验1-1、1-2、1-3三个平行样中，1-1的产气效果最好，所产气体组分中甲烷含量最高达到25.315%，1-2甲烷含量最高为16.490%，1-3甲烷含量最高为19.918%。A组试验所产气体组分甲烷含量增长趋势与文献[19]和文献[20]中产气趋势相同，可以分为缓慢增长、急剧增加，保持不变3个阶段。1-1、1-2、1-3在7～14 d时，处于第一阶段，甲烷含量增长缓慢;1-1在14～28 d，1-2、1-3在14～21 d时，处于第二阶段，甲烷含量急剧增加;28～42 d时1-1，21～42 d时1-2、1-3的甲烷含量基本保持不变或有少量下降，处于第三阶段。
在试验初期，由于培养基中加入了葡萄糖、YE等有机碳源，在一定程度上对甲烷菌起到了激活的作用[5，19-20]，因此1-1、1-2、1-3在试验开始的第一阶段甲烷含量就持续增长;培养装置中的产甲烷菌在经历了第一阶段的缓慢繁殖后，在第二阶段菌群数量和活性达到较高水平，所产气体组分的甲烷含量急剧增加；第三阶段菌群代谢所需物质的减少及代谢产物的积累抑制了产甲烷菌的生长，甲烷含量开始下降。小型试验瓶内压力的增大也有可能是抑制产气持续时间的一个因素。
B组2-1、2-2、2-3中只加入了培养基和水样，没有加入煤样，水样中的菌群只是利用了培养基中的营养成分，并没有涉及到煤样的转化作用，产气效果一般，所产气体组分的甲烷含量最高达到7.996%。B组试验一方面为A组试验做比对，说明A组试验中的菌群除利用了培养基中的营养成分外，还参与了煤样的生物气转化;另一方面B组试验能够很好地证明试验用水样中的菌群活性很好，能够利用培养基进行正常生长和活跃代谢。空白试验组CK中从煤样中解析出的甲烷，排除了A组试验中的解析气含量，为A组做了很好的对照。
2.3.2 中型煤生物转化试验产气规律
中型发酵罐煤生物转化试验产出气体组分中甲烷含量、产气趋势如图4所示。
图4 中型煤生物转化试验产气趋势
Fig.4 Gas trends of medium coal bioconversion experiment
G-1所产气体组分中甲烷含量最高为30.113%，G-2甲烷含量最高为31.052%，G-1、G-2两个发酵罐中的甲烷含量增长曲线大致相同。
与小型煤生物转化试验产气趋势图对比后，存在2个区别：① 中型煤生物转化试验产生气体组分的甲烷含量并没有经历缓慢增长阶段;② 中型试验中甲烷含量的增长期比小型试验多7 d，小型试验的增长期平均为0～28 d，而中型发酵罐的增长期为0～35 d。分析造成区别①的原因在于中型试验中甲烷组分的缓慢增长期可能提前至0～7 d，取样监测时间间隔较大，没有观察到。造成区别②的原因有2方面：其一，中型试验发酵罐上浮体积较大，产生的气体分布不均匀所致;其二，发酵罐的大体积减缓了菌群代谢有毒物质的集聚，一定程度延长了甲烷菌的繁殖生长时间。
2.4 煤生物转化产气菌群数量变化
小型煤生物转化试验菌群变化趋势如图5所示。从图5中可以看出，小型煤生物转化试验A组1-1、1-2、1-3中的菌群数量在7～14 d时，缓慢增加;14～21 d时，菌群数量急剧增加，21 d后，菌群数量减少，整体的变化曲线与小型煤生物转化试验产气趋势中的3个阶段吻合。B组2-1、2-2、2-3中虽然没有加入煤样，但是在培养基中营养物质的存在下，菌群数量也有了一定的提高。
图5 小型煤生物转化试验菌群变化趋势
Fig.5 Flora change trend of small coal bioconversion experiment
中型煤生物转化试验菌群变化趋势如图6所示。对比图6与图5可以看到，中型试验的菌群数量较小型要多一个数量级，原因是发酵罐的大体积减缓了菌群代谢有毒物质的集聚，一定程度延长了甲烷菌的繁殖生长时间。
图6 中型煤生物转化试验菌群变化趋势
Fig.6 Flora change trend of medium coal bioconversion experiment
2.5 煤样理化性质的变化
试验前后煤样工业分析见表1。由表1可以看出，试验后煤样的挥发分较试验前略微有所下降，固定碳含量也有少量下降。固定碳含量的下降说明了甲烷菌在产气的过程中利用了煤中的有机质作为碳源。此结论也与小型煤生物转化试验A与空白对照组对照后所得的结果一致。
表1 试验前后煤样工业分析
Table 1 Proximate analysis of coal before and after the experiment
2.6 煤样表面扫描电镜观察
图7为中型煤生物转化试验后煤样的扫描电镜图。可以观察到附着在煤表面的菌群，说明了在煤生物转化过程中，微生物菌群不是以游离状态存在于环境中，而是附着在煤表面进行煤的降解作用。
图7 煤样表面扫描电镜图
Fig.7 Scanning electron microscopy of coal sample surface
3 结 论
1)对沁水煤田赵庄矿区煤层气井出水进行荧光显微镜观察，发现荧光，说明该地区煤层水中存在本源产甲烷菌群。经古菌16s rDNA的提取、PCR扩增以及测序分析后，从分子生物学的角度更精准的验证了水样中存在甲烷菌，再一次保证了水样中菌群的可靠性。
2)2个煤生物转化试验中，均能够产出甲烷气体，且小型试验产出气体组分中，甲烷含量最高可达25.315%，中型试验产出气体组分中，甲烷含量最高为31.052%。试验后煤样工业分析结果中固定碳含量下降，表明赵庄矿区煤地质微生物可以利用煤作为碳源对其进行降解，有很好的产甲烷能力，为模拟原位煤生物转化的研究打下基础。
3)试验后煤样表面的电镜观察可以看到，本源菌群在进行煤降解的过程中是附着在煤表面进行煤生物转化。
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Ability of methanogens in Zhaozhuang mining area Qinshui coal field
Abstract:In order to improve coalbed methane yield of Zhaozhuang mining area,the water from coalbed methane well was tested based on the theory of methane production from coal by methanogens.The fluorescence microscope and macro metagenome sequencing of archaea's 16s rDNA V6 areas were adopted to verify the reliability of bacteria source.The simulation experiment of coal biotransformation was conducted in a small bottle and medium-sized fermentation tank for 49 days using anaerobic culture method.The change of bacteria number,gas generation law,proximate analysis of coal after the experiment were tested and investigated.The coal surface was observed by scanning electron microscope.The results showed that,the percentage of methane from small and medium-sized simulation experiment were as high as 25%,31% respectively.The change of bacteria number went through slow growth,significantly increase and slowing down which were basically consistent with gas generation law.Compared with the fixed carbon and violate of the raw material,those of coal sampale after biotransformation decreased.Some methanogens community attaching to the surface of coal for coal biodegradation were observed.
Key words:anaerobic culture;biotransformation;metagenome;scanning electron microscope (SEM);methanogens community
中图分类号：Q93-3
文献标志码：A
文章编号：1006-6772(2016)05-0113-05
收稿日期：2016-05-22;责任编辑孙淑君
DOI:10.13226/j.issn.1006-6772.2016.05.022
基金项目：山西省煤层气联合研究基金资助项目(2013012015);山西省煤基重点科技攻关资助项目(MQ2014-03)
引用格式：郭 鑫，陶昆鹏，李雁杰,等.沁水煤田赵庄矿区煤微生物产甲烷能力分析[J].洁净煤技术，2016，22(5)：113-117,122.
GUO Xin,TAO Kunpeng,LI Yanjie,et al.Ability of methanogens in Zhaozhuang mining area Qinshui coal field[J].Clean Coal Technology，2016，22(5)：113-117,122.
